探秘基因表达量衡量的奥秘

探秘基因表达量衡量的奥秘

在生物学领域，基因是生命的基本单位，而其表达则决定了细胞如何运作和个体特征。随着科学技术的发展，我们对基因及其功能有了更深入的理解，但仍然存在许多未解之谜。其中一个重要问题就是：我们该如何准确地衡量一种或多种基因在不同条件下、不同组织中以及不同时间点上的表达水平？这一问题不仅关乎基础研究，也直接影响到医学、农业等多个应用领域。

### 基因与转录本——构建生命蓝图

首先，让我们回顾一下什么是“基因”。从广义上讲，基因是一段DNA序列，它包含制造蛋白质所需的信息。这些信息通过转录过程被复制成信使RNA（mRNA），进而翻译成相应的蛋白质。在这个过程中，不同类型、数量和时机的调控因素会导致各个阶段表现出显著差异，因此了解这些变化对于揭示生物现象至关重要。

例如，在植物响应环境压力，如干旱或病害感染时，一些相关抗性或者适应性的基因为何能够快速激活并提高它们对应产物（如酶）的含量，这正是在于它们具有较高的表达水平。反之，有一些结构性或者维持基本代谢活动所必需的重要但不常用到的某类蛋白，其编码所在模板可能处于低频状态。因此，精确测定各种情况下具体哪些gene被高度表露出来，以及这种表露程度，是科研人员必须面临的一项挑战。

### 表达谱分析方法概述

为了有效地进行这方面研究，各种技术手段纷纷涌现，其中最为人熟知的是实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、微阵列芯片( microarray ) 和 RNA-Seq 等现代分子生物学工具。这几种方法都有自己独特优势，同时也伴随一定局限性，对于实验设计者而言，需要根据目标选择合适的方法，以获取最佳结果。

#### 1. 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)

作为传统且经典的方法之一，实时荧光定量 PCR 是利用引物扩增特定位点 DNA 同步监测生成 mRNA 的丰度，可以实现灵敏检测。然而，该法通常只能针对少数几个感兴趣区域开展，并不能全面反映全组数据。此外，由于需要参考内参 gene 来校准样品间变异，相比其他新兴方式依赖更多先验知识，对操作工艺要求也比较严格，从而限制其使用范围。但当用于验证已知候选 gene 时，它却能提供极具可靠的数据支持，为后续工作铺平道路。

#### 2. 微阵列芯片

微阵列技术自问世以来便成为了一项颠覆性的创新，通过将大量单链核酸固定在固态载体上，将待测样品标记后以杂交原理识别结合情况来推算目标 gne 的丰度。由于可同时检测数千甚至万计 genes，使得此法非常受欢迎。不过，此技虽快，却难免受到非专一性交互作用干扰，加之标准化流程尚缺乏一致共识，更容易造成假阳性率偏高的问题。同时由强烈背景噪声带来的数据处理复杂，也是值得关注的不容小觑障碍之一。而且近年来发现，与真实转录相比，仅凭 hybridization 数据往往无法完全还原实际状况，因此逐渐让位给更新颖、更精准的新型策略出现舞台中央.

#### 3. RNA-Seq

综合考虑以上两者优劣势，目前最先进也是前景看好的无偏向 sequencing 技术即 RNA-Seq 在近年崭露头角。不仅可以获得整个 transcriptome 信息，还无需预设任何注释，大大提升了灵敏度与覆盖率。因此，无论面对简单模型还是复杂系统，都显示出了卓越性能，比如可以帮助解析肿瘤发生发展机制，实现早期诊断；又比如助力改良农作物，提高抗逆能力等等。当然，高通道产生海量数据亟须进一步开发算法加以整理才能形成清晰结论，这是目前行业普遍存在困境，但相信未来借助人工智能等新科技介入，会迎刃而解……

### 衡량指标及计算公式探索

除了上述提及仪器设备外，要想真正掌握怎样评估 expression level ，就离不开合理数学模型支撑。例如一般来说，可采用 Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads （RPKM） 或 Transcripts Per Million （TPM） 两大主流指数来描述每条 transcritp 丰富程度：

* **RPKM** = \(\frac{10^9 \times C}{N\times L}\) - \(C\)：指读长为L碱盐长度 n 中所有 read 数目 - \(N\)：总读取 number - \(L\)： specific length in kb * **TPM** = \(\frac{C_{i}}{\sum^{n}_{j=1} C_j/N }\) 其中\(n代表total transcripts, j表示任意指定 transcripts.\)

尽管二者都试图解决归一化的问题，但 RPKM 方法易受总体文库大小波动影响，而 TPM 则更加稳定，所以越来越多的人倾向使用后者。另外还有 FPKM 、CPKM 等衍生形式不断推出，只要确保绝对值之间关系直观明朗即可达到目的，这一点始终都是关键驱动力！

当然，即使拥有再完善理论依据，如果没有足够丰富实证资料做佐证，那么最终得到结果亦不过只是空谈罢。所以说，在落实实践环节的时候，每一步均不可忽视，包括 sample collection 到 data processing 全程皆需严谨负责方能顺利完成任务!

### 应用案例剖析—癌症中的潜伏力量

说起 cancer , 不禁令人心惊胆战，因为这是全球排名第二死亡原因！然而实际上，当仔细观察那些患者身边，总会发觉背后的故事充满希望。有不少成功康复例子充分说明若及时采取措施调整生活习惯，再配合药剂治疗乃至靶向疗法，则很有机会扭转乾坤。但是为何有人轻松脱险，有人却屡遭重创？

众所周知，不同 tumor types 间存着巨大差异，同属乳腺癌内部 subtypes classification 更体现出明显层次，例如 HER2+ 型 与三阴型 肿瘤就呈现截然相反特点。如果把注意力放置到 molecular marker 上，就不难找到线索。一旦明确 target mutation 情形之后，那接下来只需聚焦 key pathways 否决掉致命风险源即可……其实很多时候顶尖医院里医生开出的 prescription 并不是盲目遵循 guidelines 而是经过 extensive profiling 后动态制定方案，为 patient 提供 personalized medicine 支持! 有效降低 relapse 概率，看似事半功倍实则蕴藏深厚智慧!

因此，把眼界扩大来看，“expression profile” 无疑已经成为推动 precision oncology 蓬勃发展的核心内容。从肿块取材开始，到最后实施 targeted therapy，全程皆围绕着 biomarkers 指导方向展开。而现实中通过 NGS 测序平台搭建数据库，然后挑选符合 criteria 条件 samples 加入 cohort group 分析趋势演绎模式，又岂止如此? 每天都会见证新的突破诞生，新鲜资讯不断传递过来，引领专业人士走上一条未知旅途。倘若你我的努力能够促成一次改变人生轨迹举措，那才是真正意义上的价值所在吧?

综上所述，通过本文简要梳理 “Gene Expression Quantification” 一路走来的艰辛历程，希望大家对此有所启迪！虽然当前仍旧面临诸多困难，不过隨著时代推进 科研事业愈加繁荣昌盛，我坚信未来将继续创造奇迹，共享美好成果！